ETUDE DU BMV PAR DIFFUSION DES RAYONS X AUX PETITS ANGLES
Pour les protéines en solution, l ’obtention de cristaux se fait généralement dans des conditions attractives. La Diffusion des Rayons X aux Petits Angles est une technique efficace pour caractériser les interactions attractives ou répulsives entre les molécules en solution, et l ’évolution des ces interactions avec la variation de paramètres physico-chimiques. Nous avons utilisé cette méthode pour caractériser le comportement du BMV en tant que macromolécule chargée en solution en fonction du pH, et de la présence de sels et de polymères, mais également pour déterminer des conditions de cristallisation du BMV.

       La Diffusion des Rayons X aux Petits Angles donne deux types
       d’informations:

  • près de l ’origine, elle permet de caractériser les interactions entre particules
    en solution (attractives ou répulsives)

  • aux plus grands angles, elle donne une information sur la forme des particules;
    ici les minima et maxima sont caractéristiques de la diffusion de particules sphériques


I - Interactions entre particules virales en solution

Spherical plant viruses: interactions in solution, phase diagrams and crystallization of Brome Mosaic Virus
M. Casselyn, J. Perez, A. Tardieu, P. Vachette, J. Witz, H. Delacroix
Acta Crystallographica Section D, 2001, Volume D57, pages 1799-1812
 
 
Effet des sels

Les interactions peuvent également être modifiées en écrantant les charges avec des sels. Nous avons utilisé deux sels, l ’acétate de sodium et le nitrate de sodium à différentes concentrations.
 

  • la présence de sels réduit les interactions répulsives entre particules virales
  • le NaNO3 est plus efficace que l ’AcNa
  • l’augmentation de la concentration en NaNO3 provoque également une modification structurale du virus (désorganisation de l ’ARN)
 
 
Effet du PEG

Le PolyEthyleneGlycol (PEG) est couramment utilisé dans la cristallisation des protéines. Nous avons utilisé deux tailles de PEG: 8000 et 20 000, à des concentrations allant de 3 à 10%, en présence ou en absence de PEG.
  • l’augmentation de la concentration de PEG provoque une diminution des interactions répulsives (attraction=précipitation).
  • le PEG 20 000 est plus efficace que le PEG 8000.
  • il y a un effet synergétique entre le PEG et les sels.
  • tous les précipités obtenus en PEG ou PEG+sel sont micro cristallins, comme le montrent la présence de pics de Bragg. La position de ces pics est la même dans chaque cas.
 



II - Cinétique de croissance des microcristaux

Growth kinetics of BMV microcrystals (article soumis)
M. Casselyn, S. Finet, A. Tardieu, H. Delacroix


Time-resolved scattering investigations of brome mosaic virus microcrystals appearance
M. Casselyn, S. Finet, A. Tardieu, H. Delacroix
Acta Crystallographica Section D, 2002, Volume D58, pages 1568-1570

 Il est possible se suivre l'apparition et la croissance des pics de diffraction, et donc de quantifier la nucléation, grâce à un appareillage de mélange rapide, ou "stopped-flow". Ces expériences ont été réalisées sur la ligne ID2, à l'ESRF (Grenoble) :  

 
evolution de l intensite diffusee

(cliquer sur les images pour les agrandir)

Les microcristaux apparaissent dès les premières secondes après le mélange du virus et du PEG. Comme aucun stade amorphe ne peut être observé avant l'apparition des pics de diffraction, on peut supposer que les noyaux de nucléation, précurseurs des microcristaux, ont déjà une structure organisée, contrairement à ce qu'avancent certaines théories de cristallisation des protéines.


 

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Cristallogénèse

Modélisation

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